Риск вирусной контаминации не равнозначен для всех препаратов крови. Иммуноглобулин по сравнению, например, с факторами свертывания или другими препаратами крови имеет почти безупречную репутацию относительно вирусной безопасности. Известно, что препараты для внутримышечного введения, полученные с помощью метода спиртового фракционирования по Кону, никогда не содержат вирусов гепатита В и С, а также ВИЧ. Препараты для внутривенного введения представляют несколько больший риск для реципиентов, главным образом из-за большой дозы, попадающей непосредственно в кровяное русло. Об этом свидетельствуют случаи заболеваний гепатитом С и один случай инфицирования вирусом гепатита В после применения этих препаратов.

Возможность контаминации готового препарата существует даже при тщательном отборе доноров, контроле сырья и соблюдении основных требований к ведению технологического процесса. Кроме того, существует риск переноса с препаратом еще неизвестных нам вирусов или вирусов, наличие которых в крови и ее препаратах в настоящее время не определяют.

Поэтому дополнительные стадии вирусной инактивации сейчас являются главным критерием гарантии качества и безопасности иммуноглобулина и других препаратов крови. Вирусная инактивация изделий крови должна быть достаточно эффективной в отношении вирусов и не должна вредить терапевтической эффективности и переносимости препарата.

Любое исследование, посвященное вирусной безопасности и ориентированное на промышленную методику, должно быть четко документировано по показателю уменьшения содержания количества вирусов (вирусная редукция), выраженного в логарифмах или в степени снижения титров, так как простой количественный показатель неадекватно отражает эффективность применяемого метода. Существует три основных подхода для оценки эффективности вирусной инактивации: 1) исследования в культуре клеток; 2) исследования на лабораторных житвотных; 3) клинические испытания. Официальным учреждением, обладающим в настоящее время наибольшим опытом в оценке этих методик, является Институт Пауля Эрлиха в Германии. Анализ вирусной безопасности, обобщенный в директивах этого института, свидетельствует, что препарат является безопасным, если производственный процесс обеспечивает общий уровень очистки и инактивации для вирусов с липидной оболочкой 1010 раз, причем на двух этапах производства это снижение титров должно быть получено не менее, чем 104 раз. Для вирусов без оболочки снижение титров должно составлять 106 раз. Один этап производства должен обеспечивать снижение не менее, чем 104 раз.

Тепловая обработка давно используется наряду с другими методами инактивации вирусов в производстве препаратов крови. Экспериментальные исследования подтверждают ее высокую эффективность против широкого спектра вирусов, включая оболочные и безоболочные. Полученные в последнее время результаты свидетельствуют о перспективности применения этого метода в технологии производства внутривенного иммуноглобулина как для повышения вирусной безопасности, так и для улучшения внутривенной переносимости препарата. Существует несколько технологий прогрева иммуноглобулина в жидком состоянии.

Целью настоящей работы было оценить возможность использования нового метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки эффективности инактивации вирусов и сравнить его с традиционными методами, а также изучить в модельных опытах эффективность инактивации вирусов для различных способов тепловой обработки препарата.

Материалы.

Получение раствора иммуноглобулина. Пасту иммуноглобулина, выделенную спиртовым методом по варианту Б , растворяли в дистиллированной воде и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации, остаточный этанол и соли удаляли ультрафильтрацией, одновременно устанавливали рН 4,6-4,8 0,1 N раствором HC1. Содержание белка корригировали до 7,0-8,0 %. В дальнейшем, для проведения экспериментов, из раствора готовили пробы с содержанием белка 5мг/мл, 50 мг/мл.

Вирусы. В модельных опытах использовали человеческие патогенные вирусы гепатита А (ВГА), гепатита В (ВГВ), гепатита С (ВГС), иммунодефицита человека ВИЧ-1, Синдбис.

ВГВ и ВГС получали из сывороток крови больных и вирусоносителей, вируссодержащую жидкость (ВИЧ-1, ВГА, Синдбис) - на культуре клеток. Для пассирования ВИЧ-1 использовали перевиваемую клеточную линию Т-лимфоцитов человека (СЕМ-SS). ВГА и вирус Синдбис пассировали на перевиваемой клеточной линии эпителия почки сирийского хомячка (ВНК-21). Клетки культивировали на модифицированной среде Дюльбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) при 37°С. Адсорбцию вирусов проводили при 37°С в течение 2-х часов, клетки отмывали дважды в культуральной среде и добавляли поддерживающую среду (DMEM с 2% ЭТС). Клетки, зараженные ВИЧ-1 и вирусом Синдбис, инкубировали при 37°С, а ВГА - при 34 °С.

Методы. Эффективность инактивации оценивали, используя два методических подхода: 1) метод полимеразной цепной реакции (ПЦР); 2) метод определения инфекционности на чувствительной линии клеток до и после прогрева.

Метод полимеразной цепной реакции. Индикация РНК-ВГС. Для определения генома вируса гепатита С использовали метод РТ-ПЦР, когда с помощью фермента ревертазы на матричной РНК синтезируется ДНК-копия вируса (кДНК), которая в дальнейшем становится матрицей для ПЦР-реакции. Содержание ВГС-РНК оценивали количественно (по результатам РТ-ПЦР в серийных разведениях образцов иммуноглобулина). Для проведения РТ-ПЦР применяли диагностические системы производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ: набор “РИБО-сорб” для выделения РНК, набор "РЕВЕРТА-R" для получения копий ДНК с ВГС-РНК, набор "АмплиCенс-200" для амплификации участка 5' некодируемой области генома ВГС.

После завершения полимеразной цепной реакции продукт амплификации выявляли методом электрофореза в 2% агарозном геле. Для электрофореза использовали горизонтальную камеру, стандартный трис-боратный буферный раствор. Нуклеиновые кислоты окрашивали бромистым этидием. Гели просматривали в УФ-трансиллюминаторе (длина волны 265 нм) и фотографировали на пленку Микрат-300.

В пробах, содержащих РНК ВГС, в геле обнаруживались специфические полосы, соответствующие амплифицированным фрагментам ДНК размером 260 пар нуклеотидов. В отрицательных пробах специфические полосы не выявлялись.

Индикация ДНК-ВГВ. Для выявления ДНК вируса гепатита В были использованы диагностические системы производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ: “ДНК-сорб-А” и "АмплиСенс-200" для выделения ДНК из исследуемого материала и амплификации консервативного участка гена ВГВ. Содержание ДНК определяли количественно по результатам тестирования в серийных разведениях.

В положительных пробах, содержащих ВГВ, в геле обнаруживалась специфические полосы, соответствующие амплифицированному фрагменту ДНК размером 470 пар нуклеотидов. В отрицательных пробах специфические полосы не выявлялись.

Метод определения инфекционности вируссодержащего материала в единицах ТСID/50/мл (ТСID/50 – от англ.tissue culture infections dose - доза, инфекционная для 50% зараженных клеток).

В растворы иммуноглобулинов вносили вируссодержащую жидкость в соотношении 1:1. После проведения процедуры инактивации контрольные и опытные образцы методом последовательных 10-кратных разведений добавляли к соответствующим клеточным линиям в 24-луночные планшеты. Результаты учитывали на 14-й день для ВИЧ-1 и ВГА, на 10-й день для вируса Синдбис по цитопатическому действию, а также по наличию вирусного антигена, определяемому иммуноферментным методом (ИФА). Концентрацию вирусов выражали в единицах ТСID/50/мл. Для достоверности результатов титрование каждой пробы повторяли три раза.

В растворы иммуноглобулина вносили следующие концентрации вирусов: ВИЧ-1 и ВГА не менее 107 TCID50/мл, а Синдбис не менее 1010 TCID50/мл. После прогрева определяли инфекционность в TCID50/мл для опытных и контрольных образцов.

Результаты и обсуждение.

Эффективность тепловой инактивации вирусов мы изучали для двух вариантов прогрева иммуноглобулина. В первом варианте прогрев проводили стандартным способом (10 часов при 60°С) при низком содержании белка и солей, слабокислом значении рН в отсутствие стабилизаторов. Во втором варианте щадящим способом (10 часов при 50°С) при содержании белка 50 мг/мл в присутствии 10% мальтозы в качестве стабилизатора, разработанном, главным образом, для снижения антикомплементарной активности и улучшения внутривенной переносимости препарата.

Любая методика инактивации вирусов, применяемая в технологии производства препаратов крови, должна быть тщательно исследована на предмет снижения концентрации вирусов. На первом этапе работы для этой цели был использован метод ПЦР, привлекательность которого заключалась в его высокой чувствительности и специфичности. Для проведения экспериментов образцы растворов иммуноглобулина, предварительно протестированные методом ПЦР, контаминировали перед прогревом сыворотками крови, содержащими геномы вирусных гепатитов В и С в высоких концентрациях. После этого опытные пробы прогревали в соответствующем режиме и тестировали контрольные и опытные образцы.

Тестирование опытных образцов препарата, содержащих до прогрева 103– 104 вирусных частиц в миллилитре, показало, что РНК ВГС полностью разрушается при 60˚С, но сохраняется при температуре 50˚С. ДНК ВГВ, как и следовало ожидать, оказалась более устойчивой к воздействию тепла и сохранялась в опытных образцах при обоих режимах обработки.

Отсутствие РНК ВГС после прогрева является доказательством его полной инактивации. В то же время наличие вирусного генома не обязательно свидетельствует о сохранении патогенных свойств, так как тепловая обработка, главным образом, повреждает ферменты и белки вирусов, а особенностью метода ПЦР является то, что в качестве источника генетического материала для репликации может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал.

Известно, что денатурация ферментов и белков ингибирует вирусную репликацию несколькими путями: 1) нарушением структуры поверхностных белков, лишая вирус возможности проникать в клетку; 2) денатурацией вирусных специфических ферментов, предотвращая репликацию нуклеиновых кислот. Поэтому обнаружение в некоторых препаратах внутривенного иммуноглобулина низких концентраций РНК или ДНК не всегда предполагает сохранение инфекционных свойств вирусов. Так, наличие РНК вируса гепатита G в четырех из десяти серий внутривенного иммуноглобулина, протестированного методом ПЦР, не привело к передаче инфекции у реципиентов препарата.

Эти данные свидетельствуют о том, что метод ПЦР недостаточно информативен для оценки эффективности инактивации, и для этой цели предпочтительнее использовать методы исследования, основанные на определении биологической активности вирусов. Поэтому на втором этапе работы мы определяли инфекционность вируссодержащего материала в единицах ТСID50/мл на чувстрительной линии клеток.

Такие агенты, как ВГВ, ВГС и некоторые другие, к сожалению, не могут быть культивированы in vitro. Поэтому мы использовали так называемые “модельные” вирусы. Главным объектом выбора был ВИЧ-1, который в соответствии с требованиями национальных органов контроля некоторых европейских стран должен быть инактивирован не менее, чем на 5 порядков только при использовании в технологии одного из методов инактивации. Кроме того, был использован ВГА, который не имеет липидной оболочки, и, как известно, может иногда передаваться с препаратами крови, и вирус Синдбис, который имеет липидную оболочку и может быть использован в качестве “модели” вируса гепатита С, ближайшими родственниками которого являются тога- и флавивирусы.

Результаты наших исследований показали, что процесс пастеризации в течение 10 часов при 60°С приводил к инактивации вирусов: для ВИЧ-1 до неопределяемого уровня, для Синдбис не менее, чем в 105 раз, а для ВГА не менее, чем в 103 раз.

Невысокий уровень инактивации ВГА объясняется его высокой резистентностью к действию повышенной температуры. Известно, что при температуре 60°С он лишь частично утрачивает инфекционность через 4-12 часов. В то же время другие виды обработок, в частности сольвент-детергентная, а также обработка хлороформом, часто используемые в технологии инактивации вирусов, вообще не действуют на этот вирус. Поэтому метод тепловой обработки имеет ряд преимуществ, так как он эффективен против большинства известных вирусов, в том числе безоболочных.

Таким образом, в результате проведенных исследований подтверждена эффективность инактивации вирусов при прогреве раствора иммуноглобулина в течение 10 часов при 60°С. Подбор условий пастеризации позволил при этом стабилизировать молекулы иммуноглобулина и сохранить их функциональную активность. Представленные данные позволяют сделать вывод о возможности включения этой стадии прогрева на заключительных этапах производства в существующий промышленный метод получения вирусинактивированного иммуноглобулина для внутривенного введения. При прогреве в течение 10 часов при 50˚С не удалось получить статистически достоверных результатов, свидетельствующих об эффективной инактивации вирусов в этом режиме.

Авторы статьи выражают искреннюю благодарность научным сотрудникам лаборатории физиологии вирусов и лаборатории биосинтеза вирусов НИИ вирусологии им.Ивановского .. кандидату медицинских наук Быченко А.Б. и Тенцову Ю.Ю. за оказанную помощь и предоставление материалов для выполнения работы.